深度解析，自身免疫疾病药物探索进展

信步杏庭 · 发表于 2015-10-9 07:17:13

本帖最后由信步杏庭于 2015-10-9 07:19 编辑

深度解析，自身免疫疾病药物探索进展

来源：生物谷 2015-03-06 17:10

2015年3月6日讯 /生物谷BIOON/ --吡啉相关周期热综合征（CAPS）是一类严重的自身免疫性疾病，它的病因是调控先天免疫反应的重要原件-炎症小体-一个蛋白质成分NLRP3发生了获得性病变。不仅如此，NLRP3的突变对于2型糖尿病、多发性硬化，阿兹海默症，痛风，动脉粥样硬化等复杂的疾病也有负面的影响。

大约在十年之前，NLRP3炎症小体作为一类先天免疫系统中的重要调节元件被科学家们鉴定出来。这个蛋白质复合体由NOD Like Receptor家族蛋白NLRP3，接口蛋白ASC以及caspase 1三类蛋白组成，主要在髓系淋巴细胞中发挥功能。NLRP3炎症小体能够被一系列不同的外刺激激活，包括细菌穿孔素以及细胞坏死产生的毒性物质（例如MHGB1）。NLRP3首先受到感应，之后与其它两类蛋白质发生聚合，最终切割proIL-1beta形成成熟的，有功能的炎性因子IL-1beta进而分泌到胞外。后续的大量研究发现NLRP3炎症小体还能够被一些非感染性刺激激活，例如ATP，固态晶体颗粒（二氧化硅，尿酸盐等），从而为一些IL-1beta介导的自身免疫病的发病机理提供了重要线索。

目前针对炎症小体开发的药物主要集中在下游细胞因子IL-Ibeta上面。其中包括重组人IL-1受体拮抗剂anakinra，IL-1beta中和性抗体kanakinumab（2012年诺华上市药物），可溶性IL-1受体诱捕剂rilonacept（Regeneron 公司08年上市药物）。另外一些小分子可以起到抑制抑制NLRP3活性的作用，比如优降糖（格列苯脲）可以特异性抑制NLRP3炎症小体导致的IL-1beta的产生。然而这些药物大多特异性不高，不仅针对NLRP3炎症小体，还对其他一些因素引起的炎症反应具有普遍的抑制作用。因此，开发特异性抑制NLRP3的相关药物是治疗CAPS等由NLRP3突变导致的自身免疫病的最佳选择。

双芳基磺酰基类化合物抑制NLRP3炎症小体的激活

早在2001年就有研究发现一系列双芳基磺酰基类化合物可以起到抑制IL-1beta的切割成熟的作用。最近爱尔兰都柏林圣三一学院生化与免疫学院Luke A J O'Neill课题组在《nature medicine》发表了他们对于其中一种化合物MCC950的详细研究。

首先，他们利用LPS与ATP联合刺激小鼠骨髓巨噬细胞诱导IL-1beta的产生（经典的炎症小体激活途径）与TNF-alpha产生（经典的NF-kappaB途径），在此基础上加入MCC950观察刺激结果。结果显示：发现MCC950能够抑制IL-1beta的产生，但对TNF-alpha的产生并没有影响。之后他们用钾离子通道激活剂nigericin代替ATP（两者都是NLRP3炎症小体的激活剂）进行刺激，结果与之前相似。以上结果暗示了MCC950抑制NLRP3激活的效应。

之后，作者向小鼠巨噬细胞感染鼠伤寒沙门氏菌（一种可以激活NLRC4炎症小体的病菌），并在此基础上加入MCC950观察抑制效果。结果显示：即使在非常高的浓度下，MCC950依然不能抑制IL-1beta与TNF-alpha的激活。同样，作者也证明了MCC950并不能抑制由poly（dA：dT）引起的AIM2炎症小体的激活，以及LPS引起的NF-kappaB的激活。以上实验充分说明了MCC950抑制效应的特异性。

之前的研究告诉我们：NLRP3激活之后会与ASC以及caspase1结合形成蛋白复合体，也就是我们之前所说的"炎症小体"，之后ASC会依赖NLRP3形成同源多聚体。作者通过生化实验发现：MCC950能够抑制细胞激活之后成熟的IL-1beta以及caspase1的形成与分泌，但并不能影响pro-IL-1beta与pro-caspase1的产生。之后，作者发现MCC950能够减弱炎症小体激活之后ASC的多聚化。

由于K离子的外流是普遍的NLRP3的激活方式，作者希望研究是否MCC950抑制了钾离子的流动。然而实验结果显示，虽然MCC950具有明显的抑制效果，它并不能抑制外界刺激导致的K离子的外流，说明MCC950作用在K离子外流的下游。另外，作者也证明了MCC950也不影响钙离子的流动。由于之前的实验中作者观察到了MCC950能够抑制ASC的多聚化，作者希望了解MCC950能否抑制NLRP3-NLRP3以及NLRP3-ASC之间的相互作用。然而实验结果显示：MCC950对此均没有影响。

之前的研究表明向小鼠腹腔注射LPS能够引起NLRP3依赖性的炎症反应。作者利用这一体内模型证明MCC950具有明显的抑制NLRP3炎症反应的作用。另外，作者利用EAE小鼠（一类模拟人类多发性硬化自身免疫疾病的小鼠模型）也同样得到了这一结论。

最后，作者利用CAPS的小鼠模型WMS（NLRP3发生获得型突变）进行体内实验，结果显示MCC950能够抑制WMS小鼠的血清中IL-18的水平，并且能够明显提高小鼠的体重与寿命。

Beta-羟基丁酸抑制NLRP3炎症小体的激活

酮体类物质（例如Beta-羟基丁酸 BHB，乙酰乙酸AcAc）是脂肪代谢的中间产物，在缺乏充足能量时，它们作为备用的ATP来源能够起到维持哺乳动物生命的作用。节食，高强度运动，补充低碳生酮类食物等方式能够提高胞内酮体类物质的含量。而且有研究发现较长时间的禁食能够降低炎症反应强度，然而这其中的原因并不清楚。耶鲁大学医学院免疫系的Vishwa Deep Dixit课题组同时发表在本期《nature medicine》上的一项研究揭示了beta-羟基丁酸抑制NLRP3激活的作用。

首先，作者利用LPS与ATP对小鼠骨髓巨噬细胞进行刺激诱导NLRP3的激活，同时向其中加入不同的酮体类物质。结果显示：beta-羟基丁酸能有明显抑制以上刺激引起的IL-1beta与caspase 1的成熟，然而它的两个同类物质：乙酰乙酸与丁酸则没有这种效应。随后作者试验了其它几种不同的NLRP3激活剂（尿酸盐晶体，二氧化硅晶体，nigericin以及几种脂类物质等），结果显示BHB均能抑制这几种物质引起的caspase 1的切割成熟。另外，BHB并不能抑制Francisella tularensis引起的AIM2炎症小体的激活或者由Salmonella typhimurium引起的的NLRC4炎症小体的激活。

由于长期禁食引起的循环系统中BHB的增多能够引起氧化应激反应，AMPK活性提升以及自噬效应等，而且这些效应都被认为可能与炎症小体的调节有关。而后续的突变分析发现：氧化应激效应的障碍或者自噬作用的障碍都不能影响BHB抑制NLRP3活性的效应，人为地提高AMPK的活性不能重现BHB抑制NLRP3的表型，AMPK活性的障碍也不能影响BHB原有的功能。另外。实验结果也显示BHB的功能不依赖于G蛋白偶联受体GPR109a。以上实验结果表明BHB在抑制NLRP3激活方面的功能与之前报道过的其它功能彼此独立。

另外，作者希望了解BHB的这一功能是否与自身的代谢过程（氧化，进入TCA循环，降低线粒体电势等）有关。但是突变分析的实验结果显示与这些都没有关系。意外的是，作者发现BHB能够明显抑制刺激条件下胞内钾离子的外流，而且能够抑制炎症小体蛋白之间的聚合。

最后，作者进行了体内实验，发现BHB能够有效抑制NLRP3介导的炎症反应，而且有趣的是，在人为注射BHB之外，给小鼠的日常饮食调配生酮类食物也能够达到相似的效果。

以上两篇研究虽然没有清楚地得到抑制NLRP3的分子机制，然而这两篇研究开拓了我们对于NLRP3炎症小体抑制药物的研发视野。更加有意思的是，如果我们能够通过进食达到药物治疗的目的，那么将会大幅降低自身免疫病患者的治疗痛苦。这也是我们应该努力的方向。（生物谷bioon.com）

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doi:10.1038/nm.3806
doi:10.1038/nm.3804

PMC:

PMID:

A small-molecule inhibitor of the NLRP3 inflammasome for the treatment of inflammatory diseases

Rebecca C Coll, Avril A B Robertson, Jae Jin Chae, Sarah C Higgins, Raúl Mu?oz-Planillo, Marco C Inserra, Irina Vetter, Lara S Dungan, Brian G Monks, Andrea Stutz, Daniel E Croker, Mark S Butler, Moritz Haneklaus, Caroline E Sutton, Gabriel Nú?ez, Eicke Latz, Daniel L Kastner, Kingston H G Mills, Seth L Masters, Kate Schroder, Matthew A Cooper & Luke A J O'Neill

Abstract

The NOD-like receptor (NLR) family, pyrin domain-containing protein 3 (NLRP3) inflammasome is a component of the inflammatory process, and its aberrant activation is pathogenic in inherited disorders such as cryopyrin-associated periodic syndrome (CAPS) and complex diseases such as multiple sclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer's disease and atherosclerosis. We describe the development of MCC950, a potent, selective, small-molecule inhibitor of NLRP3. MCC950 blocked canonical and noncanonical NLRP3 activation at nanomolar concentrations. MCC950 specifically inhibited activation of NLRP3 but not the AIM2, NLRC4 or NLRP1 inflammasomes. MCC950 reduced interleukin-1β (IL-1β) production in vivo and attenuated the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a disease model of multiple sclerosis. Furthermore, MCC950 treatment rescued neonatal lethality in a mouse model of CAPS and was active in ex vivo samples from individuals with Muckle-Wells syndrome. MCC950 is thus a potential therapeutic for NLRP3-associated syndromes, including autoinflammatory and autoimmune diseases, and a tool for further study of the NLRP3 inflammasome in human health and disease.

The ketone metabolite β-hydroxybutyrate blocks NLRP3 inflammasome-mediated inflammatory disease

Yun-Hee Youm, Kim Y Nguyen, Ryan W Grant, Emily L Goldberg,Monica Bodogai, Dongin Kim, Dominic D'Agostino, Noah Planavsky, Christopher Lupfer, Thirumala D Kanneganti, Seokwon Kang, Tamas L Horvath, Tarek M Fahmy, Peter A Crawford, Arya Biragyn, Emad Alnemri & Vishwa Deep Dixit

Abstract

The ketone bodies β-hydroxybutyrate (BHB) and acetoacetate (AcAc) support mammalian survival during states of energy deficit by serving as alternative sources of ATP1. BHB levels are elevated by starvation, caloric restriction, high-intensity exercise, or the low-carbohydrate ketogenic diet2. Prolonged fasting reduces inflammation; however, the impact that ketones and other alternative metabolic fuels produced during energy deficits have on the innate immune response is unknown2, 3, 4, 5, 6. We report that BHB, but neither AcAc nor the structurally related short-chain fatty acids butyrate and acetate, suppresses activation of the NLRP3 inflammasome in response to urate crystals, ATP and lipotoxic fatty acids. BHB did not inhibit caspase-1 activation in response to pathogens that activate the NLR family, CARD domain containing 4 (NLRC4) or absent in melanoma 2 (AIM2) inflammasome and did not affect non-canonical caspase-11, inflammasome activation. Mechanistically, BHB inhibits the NLRP3 inflammasome by preventing K+ efflux and reducing ASC oligomerization and speck formation. The inhibitory effects of BHB on NLRP3 are not dependent on chirality or starvation-regulated mechanisms like AMP-activated protein kinase (AMPK), reactive oxygen species (ROS), autophagy or glycolytic inhibition. BHB blocks the NLRP3 inflammasome without undergoing oxidation in the TCA cycle, and independently of uncoupling protein-2 (UCP2), sirtuin-2 (SIRT2), the G protein-coupled receptor GPR109A or hydrocaboxylic acid receptor 2 (HCAR2). BHB reduces NLRP3 inflammasome-mediated interleukin (IL)-1β and IL-18 production in human monocytes. In vivo, BHB or a ketogenic diet attenuates caspase-1 activation and IL-1β secretion in mouse models of NLRP3-mediated diseases such as Muckle-Wells syndrome, familial cold autoinflammatory syndrome and urate crystal-induced peritonitis. Our findings suggest that the anti-inflammatory effects of caloric restriction or ketogenic diets may be linked to BHB-mediated inhibition of the NLRP3 inflammasome.

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